组织工程骨的快速血管化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.07.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：支架复合细胞或细胞因子是构建组织工程骨快速血管化的主要策略，并为临床大段骨缺损修复提供了良好应用前景。

目的：从组织工程三要素的角度阐述目前组织工程骨血管化研究的相关进展，以寻找组织工程骨快速血管化策略的新契机，并为临床各种缺血性疾病的治疗提供启示。

方法：由第一作者检索1990至2014年PumMed数据库、维普和万方数据库相关文献。英文检索词有“bone tissue engineering，vascularization，cytokines，coculture，stem cells，osteogenesis，angiogenisis，prevascularization，patterned scaffolds”等；中文检索词有“骨缺损，血管生成，血管化组织工程骨，支架”等。经筛选后，最终纳入57篇文献进行归纳分析。

结果与结论：当下骨组织工程发展瓶颈之一在于组织工程骨早期血管化。随着自然骨组织发生过程中成骨与血管化的细胞分子水平机制的深入研究以及生物支架的发展，支架复合细胞或细胞因子策略构建快速血管化组织工程骨取得了重要成果。讯息因子作为血管生成或骨生成的“配体”的作用存在个体差异性，应注意发挥干细胞等作为“供体”的优势；同时骨生成与血管生成过程密切相关、彼此依赖，只有实现“配体”与“供体”及“成骨”与“成血管”两个层次的协调统一发展，才能真正实现组织工程骨的快速血管化。调控各种细胞或细胞因子符合严格的时间格局和空间格局表达，仿生自然骨组织的生理状态，是创造快速血管化组织工程骨值得探索的目标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 内皮祖细胞, 干细胞, 血管内皮生长因子, 骨形态发生蛋白, 缺氧诱导因子1a, 音猬因子, 血管生成, 成骨生成, 支架, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The main strategies to build rapid vascularization of bone tissue engineering focuse on cell-scaffold or cytokine-scaffold composite construction which has shed light upon the repair of large segmental bone defects.

OBJECTIVE: To clarify the relevant research progress of the vascularization of bone tissue engineering in the view of the three basic elements of tissue engineering, in order to find out new opportunities for rapid vascularization of bone tissue engineering and to provide inspiration in solving clinically ischemic diseases.

METHODS: The first author searched the PubMed, Wanfang and VIP databases for relevant literatures published from 1990 to 2014. The keywords were “bone tissue engineering, vascularization, cytokines, coculture, stem cells, osteogenesis, angiogenisis, prevascularization, scaffolds” in English and “bone defect, angiogenesis, vascularized bone tissue engineering, scaffold” in Chinese. After screening, 57 articles were included in result analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: Early vascularization is one of the current bottlenecks of bone tissue engineering development. With the in-depth study of cellular and molecular mechanism of osteogenesis and angiogenisis during natural bone development and the advanced biological scaffolds, cell-scaffold or cytokine-scaffold strategies for rapid vascularization of bone tissue engineering have achieved important achievements. Signal transduction factors acting as “ligand” of angiogenesis or osteogenesis exists individual differences, so we should pay attention to take advantage of stem cells which act as a “donor”; while osteogenesis and angiogenesis are like the two wings of a bird, they are born together and support each other and must function hand in hand, only if they develop coordinately can we realize rapid vascularization of bone tissue engineering. Regulating various cells or cytokines to meet strict spatial patterns and temporal patterns of expression and simulating the physiological state of natural bone are worth exploring to create rapidly vascularized tissue engineered bone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: Cytokines, Stents, Neovascularization, Pathologic

中图分类号:

R318

鲍小刚，许国华. 组织工程骨的快速血管化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(7): 1063-1069.

Bao Xiao-gang, Xu Guo-hua. Rapid vascularization of bone tissue engineering[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(7): 1063-1069.

图/表（结果） 1

2.1 骨组织血管化与成骨的相互关系自从怀孕后的第6周，人体皮质骨和松质骨总是在不断进行重建，贯穿整个成年期。骨重建有两个阶段：首先，血管引导破骨前体细胞来到骨组织特定部位，如骨多细胞单元，通过破骨细胞对先前骨组织的吸收；其次，血管网传送成骨祖细胞到基本多细胞单元，然后成骨细胞重新生成骨组织，从而激发新骨组织沉积。此外，机体发生骨损伤时，其修复依赖血液供应甲状旁腺激素、维生素D、干细胞等营养支持，同时这些物质之间的相互调控也是维持骨稳态的一个必要条件。可见，机体骨质的发生离不开血管供应，而且血管生成先于骨生成^[1]。

骨组织生成是骨生成与血管生成紧密偶联的过程，参与成骨作用的细胞及细胞因子大多同时参与血管形成，反之亦然。血管发生与骨发生都是一个多细胞事件，而单独的一个或少数细胞或细胞因子往往不能达到完整的血管生成或骨生成^[1]。但不能将所有相关细胞或细胞因子一概而论，目前国内外的研究主要集中在那些作用重大的细胞及细胞因子。细胞作为“供体”参与血管化或成骨的反应；细胞因子作为“配体”发挥“肥料效应”，能增强细胞的活性或诱导细胞到达特定靶位，两者相互依赖，紧密联系，共同构建了骨组织生成的信号通路^[2]。

2.2 种子细胞在构建快速血管化组织工程骨中的研究现状及新进展

2.2.1 内皮细胞与内皮祖细胞内皮细胞可自组装成血管，也可在促血管生成因子作用下形成血管。目前所有为促进血管生成所采取的细胞方法都直接或间接包含了内皮细胞。Holder等^[3]首次利用移植的内皮细胞构建了脉管系统。Koike等^[4]证实为了获得稳定且可持久的血管网，内皮细胞需要与血管周细胞共植入。成熟内皮细胞来源丰富，然而其低利用率和增殖力是该细胞的主要缺点。

内皮祖细胞是一种与造血干细胞表达相同表面标志物的自体内皮细胞源。内皮祖细胞被定义为骨髓前体细胞，骨折可以诱发内皮祖细胞从骨髓动员到外周血，并被募集在骨折部位，从而能在骨折愈合期间促进血管再生。内皮祖细胞可以在培养基中扩增1 000多倍，而成熟内皮细胞在扩增30倍后就开始衰老。内皮祖细胞早期可能通过分泌细胞因子和基质金属蛋白酶8有助于新生血管生成；而晚期的内皮祖细胞可能提供内皮细胞源和分泌基质金属蛋白酶2。将早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞共注入体内比其单一细胞注入有着更好的发生新生血管潜力^[5]。内皮祖细胞已经成功用于人骨折修复治疗^[6]、羊胫骨临界缺损的治疗^[7]。内皮祖细胞可能通过增加血管内皮细胞生长因子的表达水平刺激血管生成和骨生成，这种效应对促进早期的组织愈合和骨重建是很有必要的^[8]。内皮细胞或内皮祖细胞在修复大块骨缺损的组织工程支架的血管化中起到了关键作用，血管生成和骨生成的过程都依赖成骨细胞和内皮细胞间密切的相互作用。局部或共培养应用内皮祖细胞较单纯的内皮细胞是一项更有前景的促进骨折部位骨重建的细胞疗法^[9]。

2.2.2 脂肪干细胞脂肪干细胞以取材容易，来源广泛等优点而逐渐比胚胎干细胞及骨髓干细胞更受青睐。早期研究多表明脂肪干细胞具有多系分化和间充质干细胞的特性，在骨组织工程中有良好的运用空间。最近研究表明脂肪源性的内皮细胞明显促进微血管形成，有利于骨重建。然而，有研究表明脂肪源性的成骨细胞没有明显成骨效应，脂肪源性的成骨细胞和内皮细胞共同植入异体骨的成骨效果不如单独的内皮细胞植入效果好^[10]。类似地，在体内外单独培养脂肪间充质干细胞比脂肪间充质干细胞和脐静脉内皮细胞共培养的成骨效果好^[11]。如此可见，脂肪源性细胞可能不适合共培养，细胞间可能存在交互抑制等。

2.2.3 间充质干细胞和血管周干细胞间充质干细胞是膜内成骨和软骨内成骨重要参与者，同时与血管周细胞起源相同。间充质干细胞和内皮细胞或内皮祖细胞间的细胞间交互作用促进其分化为新生血管的重要部分CD146(+)细胞^[12]。一方面间充质干细胞可分泌细胞外基质成份并充当了壁细胞作用，促进新生血管稳定、成熟；另一方面间充质干细胞成骨作用不依赖内皮细胞,单独应用于组织工程骨也具有良好成骨的潜能^[13]。

间充质干细胞是骨组织工程中研究最多最久的细胞之一，其功能受增殖活性和分化状态限制。此外，其来源也很受限，在年老和骨质疏松症者体内干细胞活性降低。而且传统的骨髓干细胞和脂肪干细胞等需要在体外扩增，限制了紧急情况下自体细胞的应用，也增加了免疫原性反应、感染、遗传的不稳定性等^[14-15]。Park 等报道了一种间充质干细胞样定向成骨系Mx1(抗黏液病毒1亚群)能在骨损害处产生新的成骨细胞，表现出其在骨骼系统中的修复和重建潜能。Mx1可诱导或移植并迁移到骨损伤靶位、增殖并分化为成骨细胞。单一的、复制活跃的限定性抗粘液病毒1亚群可能比传统的间充质干细胞更高效^[16]。

血管周干细胞已经证实具有间充质干细胞极其相似的表型和分化潜能。荧光激活细胞分选法为组织工程提供了纯化的血管周干细胞，确保了其优越的成骨和促血管生成作用不是来源于基质血管成分中少数间充质干细胞的稀释效应。人血管周干细胞的来源丰富、细胞纯化、分选快等特点，使其可以直接注入患者体内,消除了额外的时间和体外扩增可能的风险，有替代间充质干细胞应用的潜力。血管周干细胞兼具成骨潜能和促血管生成潜能，是构建血管化骨组织工程的理想干细胞源^[17-18]。

2.2.4 许旺细胞许旺细胞在神经再生各阶段有着重要作用。而神经轴突形态发生机制与血管芽生生成机制有很多共性。研究表明许旺细胞可以分泌血管内皮生长因子、细胞外基质分子等对神经和血管的重建有着重要作用。此外，Katare等^[19]用临床级人神经干细胞系在中风实验模型中表现出促进血管芽生和神经再生，后又在小鼠下肢缺血模型中展现了治疗性血管化效果。许旺细胞可以维持目标部位的血管内皮生长因子适当水平和持续性，将许旺细胞和间充质干细胞联合应用，可能为促进组织工程骨血管化提供了重要线索^[20]。

2.2.5 胚胎干细胞和诱导多能干细胞胚胎干细胞作为人类起源的“万能细胞”，能够产生健康骨组织中所有细胞类型，能在体内外分化为血管系统和骨组织。正在研发的胚胎干细胞源血管，可能为骨组织工程快速血管化提供一种组织特异性细胞源。将人胚胎干细胞源的间充质细胞复合到三维支架，并用生物反应器灌注培养能够形成大而结实的骨组织；将移植体植入裸鼠8周后可见到明显的血管化、骨成熟和结构重建等^[21]。

诱导多能干细胞，不受伦理限制，基本拥有与胚胎干细胞相似的生物学性质。利用重编程技术可以获得功能性内皮细胞系为血管化治疗提供了良好前景。目前常规用Ⅳ胶原包被培养、血管内皮生长因子刺激驱动诱导多能干细胞分化为内皮细胞。Li等^[22]报道了一种新生儿成纤维细胞转染获得的内皮细胞的方法，所获内皮细胞局部注射可增加毛细血管密度、改善组织灌注。Orlova等^[23]开发了高效的人诱导多能干细胞分化为内皮细胞和血管周细胞，可以用于研究体外内皮细胞-血管周细胞作用缺陷的疾病模型和芽生式血管生成。诱导多能干细胞的衍生内皮细胞功能齐全，在去细胞化血管支架中具备良好的黏附、稳定、通畅、典型血管样结构^[24]。利用胚胎干细胞或诱导多能干细胞源的内皮细胞，可以改善缺血模型的血流灌注,在改善血管功能紊乱和预防血管成形术再狭窄方面表现了良好前景。

2.3 创造组织工程骨快速血管化的重要讯息因子

2.3.1 血管内皮生长因子无论在胚胎时期还是出生后的血管形成过程中，血管内皮生长因子都是最重要的“配体”之一。血管内皮生长因子的生物效应具有高度的剂量依赖性，其通过结合血管内皮生长因子受体1和2参与生理性和病理性血管生成的多个阶段。虽然血管内皮生长因子受体1比血管内皮生长因子受体2对血管内皮生长因子有更强的亲和力，但血管内皮生长因子受体1 的“诱饵”功能是通过拦截多余的血管内皮生长因子实现的。血管内皮生长因子受体1活性可能参与成骨细胞迁移过程，血管内皮生长因子受体2负责内皮细胞的增殖，单核细胞和成骨细胞的趋化性，及内皮细胞的变形^[25]。最近发现血管内皮生长因子受体2在转录后修饰中生成的一种高度动态的、复杂的信号系统中扮演核心角色，影响内皮细胞分化、增殖、迁移和渗透性。而且这种机制可能为其他常见系统的基本生理过程提供了独特见解，如组织分支形态发生、力传导和管型形成^[26]。

血管内皮生长因子刺激细胞产生基质金属蛋白酶降解基底膜和周围基质，导致内皮细胞增殖和迁移到组织间质并于此开始芽出。随后，血管周细胞增殖和迁移到新形成的管芽周围形成单层细胞层，诱导成熟。尽管血管内皮生长因子表达水平增加会促进血管芽生活动，但是长期无控性过表达血管内皮生长因子可能更倾向于导致血管形态改变和内皮系不稳，而不是促进新血管生成。另一方面，血管内皮生长因子单一上调导致新形成血管不稳，调控动物模型中单一血管内皮生长因子亚型过表达可以产生芽生式血管生成，但是新形成的血管可能发生渗漏、水肿、炎症和溃疡出血等现象。已证实血管周细胞、平滑肌细胞、血管紧张素1、血小板源性生长因子等对于维持新生血管稳定，防止其退化，最终达成功能性血管有着重要作用^[27]。

血管内皮生长因子是血管芽生生成关键上调者之一，也是成骨过程的重要“配体”，与多种细胞因子发挥协同效应，能防止相关细胞凋亡，在成骨细胞和内皮细胞相互作用中起着关键作用。血管内皮生长因子可以通过激活特定受体促进骨祖细胞募集并分化为成骨细胞，是骨的发育和再生必不可少的，尤其是大段骨缺损；血管内皮生长因子因此是骨移植体骨整合过程重要因素之一^[28]。

2.3.2 骨形态发生蛋白与Nel样蛋白1 骨形态发生蛋白是一种多功能含硫同质或异质二聚体分泌因子，属于转化因子β超家族。骨形态发生蛋白对骨、软骨形成和修复，胚胎发育时细胞增殖，维持出生后机体骨平衡的重要调解者。其中人重组骨形态发生蛋白2和人重组骨形态发生蛋白7已通过FDA广泛应用于临床椎间融合、骨不连等治疗。目前临床骨形态发生蛋白的应用多直接暴露于早期炎症阶段，此时强烈的蛋白酶活性可能使相当一部分骨形态发生蛋白失活。前期报道了利用双顺反子慢病毒载体转染人293T细胞表达人重组骨形态发生蛋白7，产生的二聚体在体内外均表现高生物活性^[29]。此外，越来越多研究旨在建立一种骨形态发生蛋白控释系统，调控其在修复阶段释放并发挥了良好作用。

Nel样蛋白1的骨诱导性和促血管作用，在骨重建治疗中表现了良好的前景。Nel样蛋白1成骨潜能与骨形态发生蛋白2相当，但Nel样蛋白1在诱导成骨的精确性及效率方面比骨形态发生蛋白2具有潜在的优势。Nel样蛋白1可能通过血管内皮生长因子信号介导预血管化作用，其缺陷的胚胎在妊娠中期新生血管生成减少^[30]。Askarinam^[31]发现Nel样蛋白1具有促进人血管周干细胞成骨分化和营养血管因子产生，显著增强了血管周干细胞介导的骨生成和血管生成。人血管周干细胞和Nel样蛋白1配合使用，可产生骨生成和血管生成的累加效应，且较人血管周干细胞联合骨形态发生蛋白2的成骨效应更理想。

根据未来的细胞疗法，一种纯化的干细胞源能够保证精致的产品特性，其稳定的安全性和有效性的也有利于其早日用于临床治疗。人血管周干细胞和Nel样蛋白1的复合物可能就是具备这种优点的细胞疗法。

2.3.3 缺氧诱导因子成骨细胞在生理和病理条件下都能部分表达缺氧诱导因子信号通路, 缺氧诱导因子是成骨细胞功能正常与否的重要调解者。此外,缺氧诱导因子1/血管内皮生长因子信号通路是骨愈合的血管化的关键调节者之一。慢病毒转导的siRNA抑制缺氧诱导因子1α的表达,可导致血管生成减少、骨生成抑制^[32]。虽然低氧被认为具有稳定缺氧诱导因子1α, 正调节血管生长因子的表达和诱发血管生成。但大量的数据表明氧含量的增加导致血管生成增多，而刺激这个过程的关键代谢物是乳酸，氧分压高低并不影响氧诱导因子1α通路的表达，因为有乳酸可以稳定伤口氧诱导因子1α的表达，并调节血管内皮生长因子的正表达^[33]。

在骨折愈合时乳酸含量增长了将近5倍，这表明在骨折愈合期间乳酸含量的增长足以稳定氧诱导因子1α，诱导血管内皮生长因子的表达和促进血管生成^[34]。尽管低氧诱发动员和募集更多的骨髓源性干细胞到骨折部位，但这些细胞并未表现出刺激效应，因为低氧在骨折修复过程不起主要作用^[35]。高压氧也增加干细胞的流动循环^[36]。有理由相信在修复骨缺损时为局部提供高氧环境很有必要，毕竟氧是许多酶活化所必需。

2.3.4 音猬因子音猬因子是控制胚胎时期骨骼和血管发育的形态发生素，但在成人损伤过程可以被激活，调节血管生成基因的表达和血管腔的形成。音猬因子可能诱导内皮祖细胞/内皮细胞到缺血部位并直接影响其管型形成；也可能引发间充质干细胞向造骨细胞分化，其中肥大软骨细胞释放血管生成生长因子和血管生成素，进而促进新生血管和新骨生成^[37]。音猬因子可能募集壁细胞、促进平滑肌细胞增殖，有助于稳定血管。同时音猬因子可能在协调血管生成和骨生成的偶联过程有重要作用^[38]。

2.4 支架设计从仿生学向智能化发展加速组织工程骨血管化进程

2.4.1 材料属性生物陶瓷羟基磷灰石和β-磷酸三钙因良好的生物活性和类似于骨组织的矿物相已经被广泛应用。这类陶瓷适宜骨祖细胞黏附和骨基质的生成，但其脆性、较低的机械性和低降解性使其不适用于大段骨缺损修复。此外，两者复合支架BCP降解率也不好。本课题组目前承担课题之一是利用数字化技术制备出高强度多孔纳米羟基磷灰石/胶原人工骨，旨在使其无机相和有机相构成比例、键和方式与自然骨中的基元组成方式相似，具有与自然骨基元相似力学分布特点和生物学特性，有望填补临床缺乏理想的解剖形状和快速骨转化功能的人工骨支架方面的空白(论文尚未形成，受邀国际大会主题发言一次)。

生物可降解聚合物因其独特优势在构建工程骨中表现出巨大潜力。其中天然水凝胶材料已是工程支架的热点之一。但它机械性差，往往难以承受体内骨组织负荷。目前通过化学的、物理的、紫外射线等交联法或与其他聚合物复合使用，以便获得生物信号和机械属性达到一种平衡状态。Annabi等^[39]研发了两级无溶剂密度气体技术并将水凝胶压缩模量提高1 000倍左右，该复合体提高了细胞的黏附和增殖能力。此外，聚乳酸-羟基乙酸/β-磷酸三钙、聚乳酸/聚己内酯、亲水多糖支链淀粉和右旋糖酐复合基质等在构建血管化组织工程骨的应用中都有较好效果^[40-42]。

支架材料的孔隙度、平均孔径会影响细胞的生长、迁移、信号传递、基因表达等。Narayan等^[43]发现较小孔径和较短空隙间距增强内皮细胞生长。体内的情况则完全不同，高孔隙率和孔径更有利于血管生成和骨生成^[44]。Klenke等^[45]研究了一批孔径范围在40-280 mm的陶瓷支架，发现在这个范围内基本符合随着孔径增加，支架内的血管生产率增加，血管发生时间也较早。Bai等^[46]制造了大孔β-磷酸三钙支架，发现增加孔径互联性促进了血管增多增大，增加支架孔径可引起生成较大管径的血管。并发现有利于血管发生的最佳孔径是400 mm，再增大孔径也不能明显影响血管生成。Ghanaati等^[47]发现β-磷酸三钙较大孔隙度有利于体液渗透和细胞迁移，当将支架孔隙率从80%降低到40%时，并将两种支架分别植入动物模型10 d，发现低孔隙率的支架中血管生成率较高孔隙率支架明显增加了。这些提示大孔隙率的支架也可能抑制细胞生长，有理由相信创造一种生物梯度材料，既含大孔又含小孔的支架可能有利于血管生成。

2.4.2 生物打印与传统的组织工程技术相比，生物打印技术可以个性化控制细胞分布以及精确控制支架成型。研究人员期望通过利用生物打印技术创造更接近自然骨组织的结构和细胞分布特性的血管化工程骨。Mironov等^[48]利用负载细胞的自组装水凝胶聚合物实现了有效的响应细胞浓度和血管化发生，而不是单一的细胞打印。类似地，Ker等^[49]也提出了生物打印图案化共培养，将骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子2等生长因子种植到基板并形成了包含结构清晰的血管网的高度成骨性支架。Schuurman^[50]应用交替沉积的热塑性纤维和负载细胞的水凝胶构建了更加接近自然骨强度和结构的支架。这种生物打印策略创造了有利于细胞排列的几何学控制，引导细胞定向分化；同时可能避免了共培养系统中关于细胞分布以及培养基选择等复杂问题。

2.4.3 精密加工技术随着计算机辅助设计/计算机辅助制造技术的发展，为开发出性能好的各种生物支架提供了巨大潜力。如标准光刻和微触印刷技术构建的微影图案基质，这种基质可以控制细胞迁移、生长、增殖，为创造血管化人工骨创造了有利条件^[51]。Raghavan等^[52]利用微成型技术创造了负载内皮细胞的含有微通道的凝胶。凝胶中的内皮细胞于24-48 h后形成了有组织地管样结构。该系统利用微制造几何学控制管型生成期间引导其分支形成，可以构建复杂的毛细血管样结构。Aubin等^[53]创造了具备图案几何学的可负载细胞的甲基丙烯酸酯水凝胶。人脐静脉内皮细胞在图案化微通道较未图案化区域排列的更整齐，并促进形成环形管样结构。图案化的水凝胶表面可以与配体、血管生长因子等绑定从而增强内皮细胞的功能。如图案化水凝胶绑定的RGD配体和血管内皮生长因子结合促进了血管生成^[54]。chiu等^[55]利用微图案化基质引导外植血管体发生内皮细胞增殖和芽生，形成组织结构良好的血管样结构，并证明了基质图案化是开放的血管分支形成的关键。Mehdi等^[56]利用精密加工技术对负载了人脐静脉内皮细胞的凝胶甲基丙烯酸酯进行微图案化修饰，并创造了高度有组织的内皮索结构，为创造三维的组织良好的血管网提供了很好策略。

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